Jednom kada je on uspostavljen, mogu se postići različiti modaliteti detektovanja struje, uključujići električno snimanje iz cele ćelije sa očuvanom ili perforiranom membranom. Ova tehnika omogućuje beleženje promena u struji ili naponu deset puta po milisekundi. Zašto se kanali bezbroj puta otvaraju bez posledica, a drugi srodni izazivaju smrt ćelije?
Akademik Stanko S. Stojilković
Kanali su proteini koji formiraju pore na ćelijskoj membrani, najčešće propustljive za jone, a u nekim slučajevima i za manje molekule. Jedna grupa kanala je propustljiva za pozitivne jone, a druga grupa je propustljiva za negativne jone. Jedni kanali propuštaju samo jednu vrstu jona, na primer jone kalijuma, natrijuma ili kalcijuma, a drugi su manje selektivni. Jedni kanali su stalno otvoreni, a drugi se samo povremeno otvaraju. Zatvaranje pore je rezultat konformacione promene koja prouzrukuje ili smanjivanje prečnika pore ili promenu položaja završnih delova proteina u odnosu na poru proteina. Deo molekula koji se pokreće da otvori ili zatvori poru zove se ulaz ili vratanca. Postoji veliki broj grupa kanala. Moja laboratorija istražuje voltažno-zavisne kanale, inositol trifosfatom-regulisane kanale i ligand-zavisne kanale.
Dva gospodina koje poznajem,
Ervin Nejer i Bert Sakman,
razvili su tehniku merenja struja
na pojedinačnim ćelijama i za to
su dobili Nobelovu nagradu.
Naša istraživanja sa ligand-zavisnim kanalima su fokusirana na proteine koji se zovu ATP-aktivirajući P2X receptori (P2XR). Ovi proteini su prvobitno otkriveni kao receptorski kanali odgovorni za neurotransmisiju sa simpatetičkih neurona na glatke mišiće, na isti način kao što su nikotinski acetilholinski receptori otkriveni po njihovoj ulozi u transmisiji signala sa neurona na skeletne mišiće, i glutaminski kanali po njihovoj analognoj funkciji u moždanim ćelijama.
ATP nije samo intracelularnai molekul, već takođe operiše kao autokrini i parakrini ekstracelularni ligand u različitim tkivima, uključujući hipofizu, gde smo po prvi put otkrili P2XR kanale 1996. godine. Postoji sedam P2X jedinica, nazvanih P2X1-P2X7, i tri istovetne ili različite jedinice su potrebne da se formira funcionalan kanal. Svaka jedinica ima dva transmembranska regiona, sa N- i C-krajevima lociranim u citoplazmi i sa ligand-zavisnim regionom sa ekstracelularne strane ćelijske membrane.
Prvi dodir pipetom
Koristeći se molekulsko-biološkim tehnikama, 1988. godine klonirali smo desetine P2X jedinica iz hipofiznih ćelija. Kloniranje odražava proces pravljenja multipnih kopija određene DNK sekvence. Kloniranje se najčešće koristi za umnožavanje DNK celog gena ili njegovih delova. Potom se DNK sekvenca može ubaciti u plazmid ili vektor, tj. kružni dvostruki DNK molekul koji je različit od hromozomalne DNK i može se replicirati nezavisno. Struktura gena, takođe, može da se menja pre nego što se ubaci u plazmid odgovarajućim metodama genetskog inženjerstva (videti dole).
U prirodi, bakterije imaju plazmide, a istraživači su sintetisali veliki broj plazmida da bi ih koristili u genetskom inženjerstvu. Da bi se željena DNK ubacila u plazmid potrebna su dva enzima, jedan nazvan restikcioni enzim i drugi nazvan DNK ligaza. Nakon ligacije, plazmid sa usađenim genom se ubacuje u ćeliju procesom koji se zove transfekcija, gen se replicira i potom se formira željeni protein. Za transfekciju smo koristili raznorodne imortalizovane ćelije sisara, uključujući čovečije HEK293 i mišje GT1-7 ćelije koje nemaju endogeni P2XR.
U analizi tih kanala koristili smo dve metode. Elektrofiziološka svojstva tih kanala smo analizirali metodama električne kontrole ćelija preko staklene elektrode (patch-clamp), i uloga tih kanala u ulasku kalcijuma u ćeliju smo karakterisali fluorescentnim merenjem kalcijuma u citoplazmi pojedinačnih ćelija.
Taj spoj je poznat kao gigaspoj,
zato što je električni otpor
između unutrašnjosti elektrode
i ekstracelularne tečnosti
veličine desetine gigaoma.
Dva gospodina koje poznajem, Ervin Nejer i Bert Sakman, razvili su patch-clamp tehniku merenja struja na pojedinačnim ćelijama i za to su dobili Nobelovu nagradu 1991. godine. Oni su došli na ideju da koriste staklene elektrode sa poliranim vrhom i prečnikom od nekoliko mikrometara (µm). Koristeći se mikromanipulatorima, pipetom su dotakli ćeliju i prvi put detektovali struju formiranu kroz pojedinačni acetilholinski kanal.
Oven Hamil i njegovi saradnici su dalje razvili tu tehniku, pokazujući da se može formirati spoj visokog otpora između pipete i ćelijske membrane. To se može postići pažljivim usisavanjem membrane, što omogućava da se deo membrane uvuče u vrh pipete. Nakon nekoliko sekundi postiže se visoki otpor i mehanička stabilnost između ćelijske membrane i staklene površine sa minimalnim tokom jona između njih. Taj spoj je poznat kao gigaspoj, zato što je električni otpor između unutrašnjosti elektrode i ekstracelularne tečnosti veličine desetine gigaoma. Jednom kada je uspostavljen gigaspoj, mogu se postići različiti modaliteti detektovanja struje, uključujići električno snimanje iz cele ćelije sa očuvanom (whole-cell recording) ili perforiranom membranom (perforated-cell recording). Ta tehnika omogućuje beleženje promena u struji ili naponu deset puta po milisekundi.
Promene u kalcijumu
Fluorescentno merenje kalcijuma u ćeliji je uspostavio Rodžer Tsen, koga sam lično poznavao, a dobio je Nobelovu nagradu za ta i slična otkrića 2008. godine. Oduševljen njegovim početnim eksperimentima, 1988. godine i sâm sam započeo eksperimente koristeći hipofizne ćelije. Uspeo sam da se dogovorim sa kompanijom „Nikon” da napravi za mene prototip takvog jednog uređaja besplatno, s tim što je moja obaveza bila da naznačim u svojim publikacijama korišćenje njihove opreme. Iz sentimentalnih razloga još čuvam taj uređaj.
U osnovi ove metode jeste da se unutrašnjost ćelija, stavljenih na predmetno staklo, ispuni fluorescentom supstancom kao što je fura-2 koja se vezuje za slobodni kalcijum, zatim se ćelije drže 60 minuta u mraku i nakon toga se postave na nosač inverznog mikroskopa sa uređajem za merenje intenziteta fluorescencije. Dinamičke promene u unutarćelijskoj koncentraciji kalcijuma se detektuju pri naizmeničnoj eksitaciji fure-2 na 340/380 nanometara (nm) i merenjem intenziteta svetlosne emisije na 520 nm. Promene u intenzitetu svetla, F340/F380, koje odslikavaju promene u citozoličnom kacijumu mogu istovremeno da se prate u 15-50 individualnih ćelija, sa oko deset merenja po sekundi.
Koristeći patch-clamp metode, mi smo sistematski izučavali biofizičke karakteristike glodarskih i čovečijih P2XR. U osnovi, strujni odgovor tokom ATP aplikacije se sastoji od tri faze: nagli rast struje uzrokovan dodatkom ATP (aktivaciona faza), usporeno opadanje struje u prisustvu liganda (faza smanjenja osetljivosti, odnosno desenzitizacija) i relativno brzo opadanje struje nakon ispiranja ATP (deaktivaciona faza).
Da bi se aktivacija i deaktivacija precizno merile potrebno je bilo nabaviti sistem za dodavanje i uklanjanje ATP u vremenu kraćem od 1 milisekunde (ms). Ti eksperimenti su pokazali da vreme deaktivacije ne zavisi od koncentracije ATP, nasuprot vremenu potrebnom za aktivaciju i desenzitizaciju kanala. Elektrofiziološki eksperimenti su, takođe, pokazali da P2XR strujni profili su veoma različiti, iako sedam P2XR kanala imaju 40-60% identičnu strukturu. Na primer, P2X4R kanal može bezbroj puta da se aktivira bez posledica po ćeliju, dok ponovljena ili produžena aktivacija sestrinskog P2X7R kanala dovodi do smrti ćelije, a da sam mehanizam tog postupka nije kompletno razjašnjen.
Nedavno smo pokazali nekoliko neobičnih karakteristika P2X7R, koje mogu da pomognu objašnjenju tog fenomena. Produžena stimulacija tih kanala prouzrokuje sekundarni rast u amplitudi struje. Takav obrazac aktivacije receptora mogao bi se objasniti usporenim dilatacijom pore kanala. Da bismo testirali tu hipotezu, zamenili smo natrijum iz ekctracelularne tečnosti velikim organskim katjonom N-metil-D-glukaminom. U tim uslovima, ATP stimulacija je još uvek rezultirala generisanjem struje, potvrđujući da je pora kanala postala propustljiva za jone većeg prečnika. Takođe smo pokazali da je mutacija tirozina-15, koja se potencijalno može fosforilisati protein kinazom C dovoljna da se promeni kinetika dilatacije kanala.
Stvaranje mehurića
Naši eksperimenti koji su u toku, takođe, pokazuju da obrazac strujnog odgovora zavisi od koncentracije liganda kao i od toga da li je primena liganda jednokratna ili višestruka. P2X7R se aktivira monofazično malim koncentracijama liganda, a bifazično većim koncentracijama. Ponovljeno stimulisanje P2X7R sa istom koncentracijom liganda dovodi do povećanja amplitude struje i usporavanja deaktivacije kanala. Takođe, kada se jednom postigne maksimalna amplituda struje, P2X7R konačno počinje da se ponaša kao i drugi kanali, tj. da odgovara na dodatne stimuluse sa monofazičnim strujama čija amplituda je određena koncentracijom liganda. Dodatni eksperimenti su pokazali da P2X7R pokazuje krakotrajno pamćenje i da fosforilacija kanala predstavlja mehanizam tog pamćenja.
Koje su fiziološke posledice ovih složenih biofizičkih promena? Najviše vremena smo posvetili ulozi tih kanala u generisanju kalcijumskih signala. Naša istraživanja pokazala su da P2X1R i P2X3R generišu lokalizovane kalcijumske signale, dovoljne da promene obrazac električne aktivnosti ili pokrenu neurotransmisiju ili sekreciju hormona, ali ne i da stimulišu transcripciju u nukleusu i modulišu mitohondrialne fukcije. S druge strane, aktivirani P2X2R, P2X4R i P2X7R generišu globalne kalcijumove signale, tj. signale koji su vidljivi u svim ćelijskim regionima, uključujući nukleus. Takođe je potvrđeno da takvi signali uzrokuju aktivaciju brojnih enzima u citoplazmi, usvajanje kalijuma u mitohondrijama i stimulaciju procesa egzocitose i genske transcripcije. U saradnji sa kliničarima, sada ispitujemo ulogu tih signala u karcenogenezi i apoptozi.
Da bismo mogli da pratimo ulogu P2XR u funckijama ćelijskih organela, obeležili smo različite ćelijske organele da bi bile vidljive na fluorescentnoj mikroskopiji. Ako ATP stimulacija na ćelijskoj membrani traje duže od 5-10 minuta, ona prouzrukuje intenzivno formiranje ispupčenja ili mehurića, što je praćeno povećanjem volumena ćelije i promenama u njenom obliku, uzrokujući nekrotičnu smrt ćelije.
Himerski proteini, poznati
i kao fuzioni proteini,
prave se spajanjem dva ili
više raznorodna gena.
Kanali su vidljivi u mehurićima, što može da sugeriše da je izdvajanje kanala pokušaj ćelije da smanji njihov negativan uticaj na ulazak jona, a potom i vode u ćeliju. Ako se stimulacija prekine na vreme, proces je reverzibilan. Produžena stimulacija, takođe, prouzrokuje širenje i separaciju endoplazmatičnih tubula, praćenu njihovom fragmentacijom i formiranjem vezikula. Taj tip promena je indikativan za početak usporene i regulisane smrti ćelije procesom apoptoze. Kada se jednom desi, fragmentacija endoplazmatičnog retikuluma je ireverzibilan proces.
Nasuprot tome, aktivacija P2X7R ne prouzrokuje nikakve promene u strukturi nuklearne membrane i Goldžijevog telašca. Ovi in vitro eksperimenti nam ilustruju šta se dešava u našim limfocitima, ćelijama odgovornim za imune odgovore, kao i sa našim glija ćelijama u mozgu, kada se endogeni P2X7R aktiviraju.
Himerski proteini
Tokom nekoliko godina mi smo, takođe, sistematski istraživali zavisnost funckije kanala od strukture proteina. Za to smo upotrebljavali tri tehnike genetskog inženjerstva: generisanje himerskih proteina, alanin ili cistein-skenirajuće mutageneze, i mutageneza pojedinačnih aminokiselina. Himerski proteini, poznati i kao fuzioni proteini, prave se spajanjem dva ili više raznorodna gena. Prema tome, translacija fuzionih gena rezultuje stvaranjem jednog polipeptida čije funkcionalne osobine treba da budu kombinacija originalnih proteina.
U našim eksperimentima, koristili smo veći broj himera u traganju za regionima proteina odgovornim za vezivanje ATP (ortosteričko vezno mesto) i raznovrsnih alosteričkih regulatora tih receptora, uključujući ivermektin (IVM), antiparazitski agent širokog spektra (Nobelova nagrada za 2015. godinu iz fiziologije i medicine Vilijamu Kempbelu i Satoši Omuri). Ovi eksperimenti ukazali su da lizin-67 – lizin-313 ektodomen sekvenca sadrži ne samo ATP vezujući domen nego je takođe odgovorna za vezivanje receptornih agonist analoga a da je transmembranski region odgovoran za vezivanje IVM.
Potom smo se fokusirali na identifikovanje specifičnih aminokiselina odgovornih za prepoznavanje ATP i IVM koristeći se skening mutagenezom, postupkom kojim se zamenjuje redom jedna po jedna aminokiselina u određenom regionu P2XR molekula da bi se precizno identifikovale one kiseline koje su odgovorne za određeni efekat. Originalne aminokiseline zamenjuju se alaninom ili nekom drugom kiselinom, po mogućstvu malom i sa inertnim metil grupama. Uloga specifičnih aminokiselina je potom studirana u detalje konstrukcijom mutanata, u kojima je aminokiselina od interesa zamenjivana baznim, kiselim, hidrofibičnim i/ili polarnim aminokiselinama.
Nije urednik nego akademik
Ovdenijereč oStankuStojiljkovićuurednikuovogčasopisa, već oakademikuStankuStojilkoviću, kojijegreškommatičaraizgubiojednoslovouprezimenukadajeupisanumatičnuknjigurođenih, štosepokazalokorisnimurazlikovanjudoprinosaovedveosobenauci. Dr Stojilković je diplomirao je na Prirodno-matematičkom fakultetu u Novom Sadu 1974. godine na studijskoj grupi biologija, magistrirao na Prirodno-matematičkom fakultetu u Beogradu 1978. (oblast fiziologija), a doktorirao na Prirodno-matematičkom fakultetu u Novom Sadu 1982. godine (oblast neuroendokrinologija). Od 1975-1985. godine radio je na Prirodno-matematičkom fakultetu u Novom Sadu kao asistent, odnosno docent, a 1985 godine odlazi u SAD, Betezda, u Nacionalni institut za zdravlje deteta i humani razvoj kao gost istraživač u laboratoriju dr Kevina DŽ. Keta. Godine 1988. dr Stojilković zasniva radni odnos sa Nacionalnim institutom za zdravlje deteta i humani razvoj kao gostujući naučnik, a 1993. izabran je u zvanje istraživača (u rangu višeg naučnog saradnika) i rukovodioca Laboratorije za ćelijsku signalizaciju. Godine 1998 izabran je u zvanje višeg istraživača (u rangu naučnog savetnika) i rukovodioca Odseka za ćelijsku signalizaciju gde se i sada nalazi. Kratka karta naučnih rezultata dr Stojilkovića obuhvata: 211 PubMed publikacija u naučnim časopisima i 48 rada u udzbenicima, monografijama i zbornicima sa skupova; indeks citiranosti oko 9.000; H index = 55. Više od 50 publikacija je posvećena P2XR kanalima. Za detalje čitaoci se upucuju na publikaciju „Activation and regulation of purinergic P2X receptor channels”. Pharmacol Rev 63: 641-683, 2011.
