SKLAPANJE PAMĆENJA

SRBI U ĆELIJSKOJ VODI

Ćelija (Vikipedija)

Odavno je poznato da fizičko-hemijska svojstva vode u ćelijama nisu ista kao u vanćelijskom prostoru, međutim još nije nađen ubedljiv biofizički model koji bi objasnio ovu razliku. Misteriozno ponašanje vode u biološkim sistemima proizvelo je niz „mističnih” teorija.

Prof. dr Pavle R. Anđus

Nobelova nagarada 2003. godine za hemiju podeljena je između Piter Agrija (Peter Agre) sa Džon Hopkins Univerziteta iz Baltimora i Rod Makkinona (Rod MacKinnon) sa Rokfelerovog univerziteta u Njujorku, a za  istraživanja strukture i funkcije proteinskih kanala za transport vode i jona kroz ćelijsku membranu. Dok su kanali za jone poznati još od 60-tih godina i već su bili predmet Nobelove nagrade (v. dole) kanali za vodu otkriveni su tek u poslednjoj deceniji prošlog veka. Za to je zaslužan dr Agri koji ih je nazvao akvaporinima i objasnio kako se selektivnost za vodu u odnosu na jone postiže sistemom vodoničnih veza u samoj pori kanala.

Vest o ovoj Nobelovoj nagradi dočekao sam na početku svoje akademske karijere sa ushićenjem i osećajem nostalgije. Odmah sam se setio seminara 1992. godine u uglednoj Marinsko-biološkoj laboratoriji Vuds Hol u SAD, kada sam smatran čudakom, jer pravim problem od nečeg tako banalnog i dobro poznatog kao što je ćelijski transport vode. Otkuda takva reakcija?

Biofizika membranskog transporta bila je duže od tri decenije pod dominacijom istraživanja jonskog transporta. Razvoj ove oblasti iniciran je pedesetih godina prošlog veka istraživanjima jonske osnove nervnog impulsa nobelovaca Alana Hočkina (Alan Hodgkin) i Endrju Hakslija (Andrew Huxley), a poseban razvoj usledio je otkrićem nove tehnike nametnute voltaže na fragmentu membrane (patch-clamp) čiji su izumitelji takođe nobelovci, nemački naučnici Bert Sakman i Ervin Neher. Ova tehnika je omogućila elektrofiziološku eksploraciju pojedinačnih makromolekulskih kompleksa proteina tj. jonskih vratnica i kanala ugrađenih u membrane kako biljnih tako i životinjskih ćelija. Ovaj novi eksperimentalni pristup doveo je do značajnog razvoja fiziologije ekscitabilnih ćelija i neurofiziologije uopšte.

Sve do kraja osamdesetih godina smatralo
se da se molekuli vode transportuju zajedno
sa jonima kroz transmembranske kanale.

Međutim, u ovom periodu transport molekula vode, iako od suštinske važnosti za elektro-osmotsku ravnotežu ćelija, nije privlačio posebnu pažnju istraživača. Sve do kraja osamdesetih godina smatralo se da se molekuli vode transportuju zajedno sa jonima kroz transmembranske kanale. Predloženo je i više modela pasivnog prolaska molekula vode kroz slobodne prostore u membranskom lipidnom dvosloju. Da li zbog „šasivnoh” odnosa nauke prema pasivnom transportu vode ili zbog fascinacije jonskim kanalima, no tek početkom devedesetih godina, otkrićem CHIP (channel forming membrane integral protein) makromolekula u eritrocitima, razotkrivena je, kako u životinja tako i u biljaka cela populacija membranskih kanala – akvaporina, selektivnih za tako životno važan, naizgled jednostavan, ali još uvek nedovoljno ispitan molekul kakav je voda.

Membrana (Vikipedija)

Poseban biofizički problem predstavlja sama struktura tj. uređenost vode u živim sistemima. Na ovom polju polomljena su mnoga naučna koplja. Odavno je poznato da fizičko-hemijska svojstva vode u ćelijama nisu ista kao u vanćelijskom prostoru, međutim još nije nađen ubedljiv biofizički model koji bi objasnio ovu razliku. Misteriozno ponašanje vode u biološkim sistemima proizvelo je niz „mističnih” teorija, počev od one Borisa Derjagina (odbačene tek nakon desetak godina) o polimerizaciji vode (polywate) koja je u svoje vreme uzdrmala mnoge ozbiljne naučne autoritete, pa do naizgled neozbiljne, ali patentirane teorije o klasterima vode za koje se smatra da su prisutni samo u amnionskoj tečnosti fetusa ili u lekovitoj vodi iz svetilišta u Lurdu! Ipak, rešenje zagonetke ponašanja „biološke” vode moralo je biti na samoj ćelijskoj membrani.

U Institut za opštu i fizičku hemiju stigao sam 1981. godine, kao tek diplomirani student molekularne biologije i fiziologije. Institutom je rukovodio profesor Dušan Vučelić kome je pogodovalo da ima biologa u svojoj multidisciplinarnoj ekipi biofizičara, i ja sam se zadesio u „pravo vreme na pravom mestu”. Problematika kojom je trebalo da počnem da se bavim bila je upravo biofizika membranskog transporta vode.

U NMR laboratoriji Instituta, primenom originalne metode dr Slobodana Macure (tada već na postdoktorskim studijama u inostranstvu, a sada direktora Odeljenja  za magnetnu rezonancu Mejo klinike u Ročesteru, SAD), merili smo transport vode kroz ćelijsku membranu slatkovodne alge iz porodice harofita, Characeae. Došli smo do zanimljivih rezultata vezanih za temperatursku zavisnost transmembranskog transpota vode u ove alge, koji je pokazivao neočekivano nelinearno ponašanje. Naime, brzina transmembranske izmene vode naglo je opadala u okolini 12 i 300 C.

Slobodan Macura (Vikipedija)

Nekako paralelno sa ovim nalazima došao sam, pretragom literature, do radova prof. Valter Drost-Hansena sa Univerziteta u Majamiju o faznim prelazima vode na površinama. Radilo se o biofizičkom modelu koji opisuje reorganizaciju molekula vode na površinama i promene strukture vodenih slojeva upravo na karakterističnim temperaturama maksimuma poluvremena transmembranske izmene vode u našim  eksperimentima. Štaviše, naši nalazi sa transportom vode u Characeae pokazivali su izrazitu sličnost sa termalnim profilima dobijenima za fazne prelaze vode u veštačkim fizičko-hemijskim sistemima.

Desilo se da je saradnik Drost-Hansena, Džejms Kleg (James Clegg) saznao za naš rad i tako je otpočela pismena komunikacija i razmena iskustava i rezultata koja se 1990. godine završila pozivom da održim predavanje na kongresu Američkog hemijskog društva u San Dijegu. Nažalost, novca za put nije bilo i sam Drost-Hansen se ponudio da prezentira u moje ime naše rezultate, i tako i bi!

Upravo je membranska voda mogla biti
jedan od važnih strukturnih faktora
u vezi sa opštom funkcijom membrane.

U kasnijim elektrofiziološkim eksperimentima otkrili smo da i kriva temperaturske zavisnosti membranske razlike jonskih potencijala alge Chara pokazuje izrazite prelome na temperaturama 15 i 300 C, baš kao i vodeni fazni prelazi. Vrlo slična temperaturska zavisnost ukazivala je na opšti mehanizam u osnovi termalnih promena membranske građe i funkcije, kao što su membranski potencijal odn. transmembranski transport vode. Upravo je membranska voda mogla biti jedan od važnih strukturnih faktora u vezi sa opštom funkcijom membrane.

Funkcionalni značaj membranske vode dramatično je ilustrovan u elektrofiziološkim eksperimentima zamene obične vode teškom vodom (deuterijum oksid, D2O). Efekat dodatka samo jednog neutrona u molekul vode (zamena vodonika deuterijumom) bio je iznenađujući – D2O je izazivala naglu membransku depolarizaciju nalik ekscitatornim procesima biljne ćelije. Ovo otkriće je otvorilo celo novo polje istraživanja uloge vode u strukturi i funkciji jonskih kanala, pri čemu izomer D2O ima ulogu vodene strukturno-funkcionalne sonde.

Na polju ovih istraživanja naročito plodnu saradnju imali smo sa ekipom prof. Genrika N. Berestovskog iz Instituta ćelijske biofizike Naučnog centra u Pušćinu pod Moskvom. Saradnici ove laboratorije čak su nam i pomogli da formiramo u Beogradu našu elektrofiziološku laboratoriju sa patch-clamp instrumentacijom (v. gore) prvu te vrste u zemlji.

Tada smo prvi put pretpostavili
postojanje posebnih membranskih kanala
koji bi provodili samo vodu nasuprot
kanalima za katjone provodnim i za vodu.

Međutim, danas nakon dodele Nobelove nagrade za otkriće akvaporina s nostalgijom se prisećam jedne posebne serije eksperimenata koja je čak bila predmet mog magistarskog rada. Upotrebom različitih farmakoloških blokatora transporta kroz ćelijsku membranu na karakterističnim temperaturama tada smo uočili da postoje diferencijalni efekti na transport vode koji su mogli biti objašnjeni postojanjem dva različita membranska kanala za vodu. Tada smo, u stvari, prvi put pretpostavili postojanje posebnih membranskih kanala koji bi provodili samo vodu nasuprot kanalima za katjone provodnim i za vodu. Posebni kanali za vodu bili bi „usko grlo” transporta vode u okolini 15 i 300 C, što je moglo da objasni nagli pad transporta vode na tim temperaturama.

Stanko Stojilković (Vikipedija)

Predloženo je da je ovo usporenje protoka vode kroz membranu upravo uslovljeno faznim prelazima membranske vode po Drost-Hansenu. Drugoj vrsti termalnih promena, u strukturi membranskih lipida, predložena je uloga u uvođenju ćelijske membrane u optimalno stanje fizičko-hemijskog medijuma za organizaciju proteinskih transmembranskih kanala. Pokazalo se da transport vode i provodljivost jonskih kanala za kalijum reaguju poput sistema sa termosenzorima za granice optimalnog biokinetičkog opsega.

„Dobro je dok daju Nobelovu nagradu za
našu oblast istraživanja, a pravde u
ovoj struci ionako nikad nije ni bilo…”
(Stanko Stojilković)

Ulogu molekularno-biološkog termosenzora mogla je odigrati membranska (površinska) voda sa svojim faznim prelazima u uskim oblastima na granicama biokinetičkog opsega temperatura. Ovu hipotezu i rezultate koji su joj prethodili publikovali smo 1991. godine u domaćem časopisu Periodicum biologorum. Sledeća godina bila je prelomna u mojoj karijeri –dobio sam stipendiju da pohađam prestižni kurs neurobiologije u Vuds Holu, SAD, gde sam održao „uvrnuti” seminar s početka ovog teksta. Međutim, nešto kasnije te godine Piter Agri u časopisu Science publikuje prvi rad o akvaporinima. Ostalo je istorija…

Kada sam prijatelju i kolegi Stanku Stojilkoviću, iz NIH-a u Vašingtonu ispričao ovu istu priču dobio sam odgovor: „Dobro je dok daju Nobelovu nagradu za našu oblast istraživanja, a pravde u ovoj struci ionako nikad nije ni bilo…” Ipak, moje srce je na mestu, jer znam da sam tih davnih godina dotakao jednu od bezbrojnih, ali ne i lako dostupnih istina prirode.

O autoru

Vladan Milenkovic

Ostavite komentar