Једном када је он успостављен, могу се постићи различити модалитети детектовања струје, укључујићи електрично снимање из целе ћелије са очуваном или перфорираном мембраном. Ова техника омогућује бележење промена у струји или напону десет пута по милисекунди. Зашто се канали безброј пута отварају без последица, а други сродни изазивају смрт ћелије?
Академик Станко С. Стојилковић
Канали су протеини који формирају поре на ћелијској мембрани, најчешће пропустљиве за јоне, а у неким случајевима и за мање молекуле. Једна група канала је пропустљива за позитивне јоне, а друга група је пропустљива за негативне јоне. Једни канали пропуштају само једну врсту јона, на пример јоне калијума, натријума или калцијума, а други су мање селективни. Једни канали су стално отворени, а други се само повремено отварају. Затварање поре је резултат конформационе промене која проузрукује или смањивање пречника поре или промену положаја завршних делова протеина у односу на пору протеина. Део молекула који се покреће да отвори или затвори пору зове се улаз или вратанца. Постоји велики број група канала. Моја лабораторија истражује волтажно-зависне канале, иноситол трифосфатом-регулисане канале и лиганд-зависне канале.
Два господина које познајем,
Ервин Нејер и Берт Сакман,
развили су технику мерења струја
на појединачним ћелијама и за то
су добили Нобелову награду.
Наша истраживања са лиганд-зависним каналима су фокусирана на протеине који се зову ATP-активирајући P2X рецептори (P2XR). Ови протеини су првобитно откривени као рецепторски канали одговорни за неуротрансмисију са симпатетичких неурона на глатке мишиће, на исти начин као што су никотински ацетилхолински рецептори откривени по њиховој улози у трансмисији сигнала са неурона на скелетне мишиће, и глутамински канали по њиховој аналогној функцији у можданим ћелијама.
ATP није само интрацелуларнаи молекул, већ такође оперише као аутокрини и паракрини екстрацелуларни лиганд у различитим ткивима, укључујући хипофизу, где смо по први пут открили P2XR канале 1996. године. Постоји седам P2X јединица, названих P2X1-P2X7, и три истоветне или различите јединице су потребне да се формира фунционалан канал. Свака јединица има два трансмембранска региона, са N- и C-крајевима лоцираним у цитоплазми и са лиганд-зависним регионом са екстрацелуларне стране ћелијске мембране.
Први додир пипетом
Користећи се молекулско-биолошким техникама, 1988. године клонирали смо десетине P2X јединица из хипофизних ћелија. Клонирање одражава процес прављења мултипних копија одређене ДНК секвенце. Клонирање се најчешће користи за умножавање ДНК целог гена или његових делова. Потом се ДНК секвенца може убацити у плазмид или вектор, тј. кружни двоструки ДНК молекул који је различит од хромозомалне ДНК и може се реплицирати независно. Структура гена, такође, може да се мења пре него што се убаци у плазмид одговарајућим методама генетског инжењерства (видети доле).
У природи, бактерије имају плазмиде, а истраживачи су синтетисали велики број плазмида да би их користили у генетском инжењерству. Да би се жељена ДНК убацила у плазмид потребна су два ензима, један назван рестикциони ензим и други назван ДНК лигаза. Након лигације, плазмид са усађеним геном се убацује у ћелију процесом који се зове трансфекција, ген се реплицира и потом се формира жељени протеин. За трансфекцију смо користили разнородне имортализоване ћелије сисара, укључујући човечије HEK293 и мишје GT1-7 ћелије које немају ендогени P2XR.
У анализи тих канала користили смо две методе. Електрофизиолошка својства тих канала смо анализирали методама електричне контроле ћелија преко стаклене електроде (patch-clamp), и улога тих канала у уласку калцијума у ћелију смо карактерисали флуоресцентним мерењем калцијума у цитоплазми појединачних ћелија.
Тај спој је познат као гигаспој,
зато што је електрични отпор
између унутрашњости електроде
и екстрацелуларне течности
величине десетине гигаома.
Два господина које познајем, Ервин Нејер и Берт Сакман, развили су patch-clamp технику мерења струја на појединачним ћелијама и за то су добили Нобелову награду 1991. године. Они су дошли на идеју да користе стаклене електроде са полираним врхом и пречником од неколико микрометара (µm). Користећи се микроманипулаторима, пипетом су дотакли ћелију и први пут детектовали струју формирану кроз појединачни ацетилхолински канал.
Овен Хамил и његови сарадници су даље развили ту технику, показујући да се може формирати спој високог отпора између пипете и ћелијске мембране. То се може постићи пажљивим усисавањем мембране, што омогућава да се део мембране увуче у врх пипете. Након неколико секунди постиже се високи отпор и механичка стабилност између ћелијске мембране и стаклене површине са минималним током јона између њих. Тај спој је познат као гигаспој, зато што је електрични отпор између унутрашњости електроде и екстрацелуларне течности величине десетине гигаома. Једном када је успостављен гигаспој, могу се постићи различити модалитети детектовања струје, укључујићи електрично снимање из целе ћелије са очуваном (whole-cell recording) или перфорираном мембраном (perforated-cell recording). Та техника омогућује бележење промена у струји или напону десет пута по милисекунди.
Промене у калцијуму
Флуоресцентно мерење калцијума у ћелији је успоставио Роџер Тсен, кога сам лично познавао, а добио је Нобелову награду за та и слична открића 2008. године. Одушевљен његовим почетним експериментима, 1988. године и сâм сам започео експерименте користећи хипофизне ћелије. Успео сам да се договорим са компанијом „Никон” да направи за мене прототип таквог једног уређаја бесплатно, с тим што је моја обавеза била да назначим у својим публикацијама коришћење њихове опреме. Из сентименталних разлога још чувам тај уређај.
У основи ове методе јесте да се унутрашњост ћелија, стављених на предметно стакло, испуни флуоресцентом супстанцом као што је фура-2 која се везује за слободни калцијум, затим се ћелије држе 60 минута у мраку и након тога се поставе на носач инверзног микроскопа са уређајем за мерење интензитета флуоресценције. Динамичке промене у унутарћелијској концентрацији калцијума се детектују при наизменичној екситацији фуре-2 на 340/380 нанометара (nm) и мерењем интензитета светлосне емисије на 520 нм. Промене у интензитету светла, F340/F380, које одсликавају промене у цитозоличном кацијуму могу истовремено да се прате у 15-50 индивидуалних ћелија, са око десет мерења по секунди.
Користећи patch-clamp методе, ми смо систематски изучавали биофизичке карактеристике глодарских и човечијих P2XR. У основи, струјни одговор током ATP апликације се састоји од три фазе: нагли раст струје узрокован додатком ATP (активациона фаза), успорено опадање струје у присуству лиганда (фаза смањења осетљивости, односно десензитизација) и релативно брзо опадање струје након испирања ATP (деактивациона фаза).
Да би се активација и деактивација прецизно мериле потребно је било набавити систем за додавање и уклањање ATP у времену краћем од 1 милисекунде (ms). Ти експерименти су показали да време деактивације не зависи од концентрације ATP, насупрот времену потребном за активацију и десензитизацију канала. Електрофизиолошки експерименти су, такође, показали да P2XR струјни профили су веома различити, иако седам P2XR канала имају 40-60% идентичну структуру. На пример, P2X4R канал може безброј пута да се активира без последица по ћелију, док поновљена или продужена активација сестринског P2X7R канала доводи до смрти ћелије, а да сам механизам тог поступка није комплетно разјашњен.
Недавно смо показали неколико необичних карактеристика P2X7R, које могу да помогну објашњењу тог феномена. Продужена стимулација тих канала проузрокује секундарни раст у амплитуди струје. Такав образац активације рецептора могао би се објаснити успореним дилатацијом поре канала. Да бисмо тестирали ту хипотезу, заменили смо натријум из екцтрацелуларне течности великим органским катјоном N-метил-D-глукамином. У тим условима, ATP стимулација је још увек резултирала генерисањем струје, потврђујући да је пора канала постала пропустљива за јоне већег пречника. Такође смо показали да је мутација тирозина-15, која се потенцијално може фосфорилисати протеин киназом C довољна да се промени кинетика дилатације канала.
Стварање мехурића
Наши експерименти који су у току, такође, показују да образац струјног одговора зависи од концентрације лиганда као и од тога да ли је примена лиганда једнократна или вишеструка. P2X7R се активира монофазично малим концентрацијама лиганда, а бифазично већим концентрацијама. Поновљено стимулисање P2X7R са истом концентрацијом лиганда доводи до повећања амплитуде струје и успоравања деактивације канала. Такође, када се једном постигне максимална амплитуда струје, P2X7R коначно почиње да се понаша као и други канали, тј. да одговара на додатне стимулусе са монофазичним струјама чија амплитуда је одређена концентрацијом лиганда. Додатни експерименти су показали да P2X7R показује кракотрајно памћење и да фосфорилација канала представља механизам тог памћења.
Које су физиолошке последице ових сложених биофизичких промена? Највише времена смо посветили улози тих канала у генерисању калцијумских сигнала. Наша истраживања показала су да P2X1R и P2X3R генеришу локализоване калцијумске сигнале, довољне да промене образац електричне активности или покрену неуротрансмисију или секрецију хормона, али не и да стимулишу трансцрипцију у нуклеусу и модулишу митохондриалне фукције. С друге стране, активирани P2X2R, P2X4R и P2X7R генеришу глобалне калцијумове сигнале, тј. сигнале који су видљиви у свим ћелијским регионима, укључујући нуклеус. Такође је потврђено да такви сигнали узрокују активацију бројних ензима у цитоплазми, усвајање калијума у митохондријама и стимулацију процеса егзоцитосе и генске трансцрипције. У сарадњи са клиничарима, сада испитујемо улогу тих сигнала у карценогенези и апоптози.
Да бисмо могли да пратимо улогу P2XR у фунцкијама ћелијских органела, обележили смо различите ћелијске органеле да би биле видљиве на флуоресцентној микроскопији. Ако ATP стимулација на ћелијској мембрани траје дуже од 5-10 минута, она проузрукује интензивно формирање испупчења или мехурића, што је праћено повећањем волумена ћелије и променама у њеном облику, узрокујући некротичну смрт ћелије.
Химерски протеини, познати
и као фузиони протеини,
праве се спајањем два или
више разнородна гена.
Канали су видљиви у мехурићима, што може да сугерише да је издвајање канала покушај ћелије да смањи њихов негативан утицај на улазак јона, а потом и воде у ћелију. Ако се стимулација прекине на време, процес је реверзибилан. Продужена стимулација, такође, проузрокује ширење и сепарацију ендоплазматичних тубула, праћену њиховом фрагментацијом и формирањем везикула. Тај тип промена је индикативан за почетак успорене и регулисане смрти ћелије процесом апоптозе. Када се једном деси, фрагментација ендоплазматичног ретикулума је иреверзибилан процес.
Насупрот томе, активација P2X7R не проузрокује никакве промене у структури нуклеарне мембране и Голџијевог телашца. Ови in vitro експерименти нам илуструју шта се дешава у нашим лимфоцитима, ћелијама одговорним за имуне одговоре, као и са нашим глија ћелијама у мозгу, када се ендогени P2X7R активирају.
Химерски протеини
Током неколико година ми смо, такође, систематски истраживали зависност фунцкије канала од структуре протеина. За то смо употребљавали три технике генетског инжењерства: генерисање химерских протеина, аланин или цистеин-скенирајуће мутагенезе, и мутагенеза појединачних аминокиселина. Химерски протеини, познати и као фузиони протеини, праве се спајањем два или више разнородна гена. Према томе, транслација фузионих гена резултује стварањем једног полипептида чије функционалне особине треба да буду комбинација оригиналних протеина.
У нашим експериментима, користили смо већи број химера у трагању за регионима протеина одговорним за везивање ATP (ортостеричко везно место) и разноврсних алостеричких регулатора тих рецептора, укључујући ивермектин (IVM), антипаразитски агент широког спектра (Нобелова награда за 2015. годину из физиологије и медицине Вилијаму Кемпбелу и Сатоши Омури). Ови експерименти указали су да лизин-67 – лизин-313 ектодомен секвенца садржи не само ATP везујући домен него је такође одговорна за везивање рецепторних агонист аналога а да је трансмембрански регион одговоран за везивање IVM.
Потом смо се фокусирали на идентификовање специфичних аминокиселина одговорних за препознавање ATP и IVM користећи се скенинг мутагенезом, поступком којим се замењује редом једна по једна аминокиселина у одређеном региону P2XR молекула да би се прецизно идентификовале оне киселине које су одговорне за одређени ефекат. Оригиналне аминокиселине замењују се аланином или неком другом киселином, по могућству малом и са инертним метил групама. Улога специфичних аминокиселина је потом студирана у детаље конструкцијом мутаната, у којима је аминокиселина од интереса замењивана базним, киселим, хидрофибичним и/или поларним аминокиселинама.
Није уредник него академик
Овде није реч о Станку Стојиљковићу уреднику овог часописа, већ о академику Станку Стојилковићу, који је грешком матичара изгубио једно слово у презимену када је уписан у матичну књигу рођених, што се показало корисним у разликовању доприноса ове две особе науци. Др Стојилковић је дипломирао је на Природно-математичком факултету у Новом Саду 1974. године на студијској групи биологија, магистрирао на Природно-математичком факултету у Београду 1978. (област физиологија), а докторирао на Природно-математичком факултету у Новом Саду 1982. године (област неуроендокринологија). Од 1975-1985. године радио је на Природно-математичком факултету у Новом Саду као асистент, односно доцент, а 1985 године одлази у САД, Бетезда, у Национални институт за здравље детета и хумани развој као гост истраживач у лабораторију др Кевина Џ. Кета. Године 1988. др Стојилковић заснива радни однос са Националним институтом за здравље детета и хумани развој као гостујући научник, а 1993. изабран је у звање истраживача (у рангу вишег научног сарадника) и руководиоца Лабораторије за ћелијску сигнализацију. Године 1998 изабран је у звање вишег истраживача (у рангу научног саветника) и руководиоца Одсека за ћелијску сигнализацију где се и сада налази. Кратка карта научних резултата др Стојилковића обухвата: 211 PubMed публикација у научним часописима и 48 рада у удзбеницима, монографијама и зборницима са скупова; индекс цитираности око 9.000; H индеx = 55. Више од 50 публикација је посвећена P2XR каналима. За детаље читаоци се упуцују на публикацију „Activation and regulation of purinergic P2X receptor channels”. Pharmacol Rev 63: 641-683, 2011.
